脉管性疾病细胞研究

除了众所周知的细胞如内皮细胞、周细胞和肥大细胞外，还有一些细胞的表型和作用只有推测，缺少实验证明。它们被称为“基质细胞”成“间质细胞*.用来描述它们在血管缩中尚不明确的作用。早期研究中，表达有增殖因子灿a、单核细胞/巨噬细胞标志物和抗原呈递细胞标志物的一类细胞称为真皮树突状细胞(Gonzalez-Crussi和Reyes-Mugica，1991)。这些细胞分布在血管周围，但不与周细胞或内皮细胞直接接触。Smoller和Apfelberg(1993)检测到了相似的表达增殖因子Xa的细胞，还有一些表达CD34和-SMA的细胞。根据这些结果，他们推测这些是可以分化成内皮细胞，周细胞和树突细胞的原始细胞。Nguyen及其同事(2004)对这一理论进行扩充，认为血管瘤中新生血管周围存在因子Xa阳性/cx-SMA阴性细胞，他们还表明，这些细胞共表达巨噬细胞标志物CD68和HLA-DR，且形态呈树突状。有研究者推测这些基质细胞分泌血管生成因子和细胞因子，并且可以影响血管榴中内皮细胞的增殖和分化。

通过免疫组织化学检测了血管瘤生长和消退期蛋白质的表达，通过原位杂交和反转录酶聚合链反应(RT-PCR)检测到mRNA表达。免疫组织化学是利用组织切片检测其是否存在特异性蛋白的抗体结合的一种间接方法，可以显示蛋白存在的位置，但不能鉴定生物合成的位点。原位杂交技术检测mRNA转录，可以揭示基因表达的位点，但分辨率较低，且难以检测细胞来源。RT-PCR可以对组织标本中的mRNA水平进行定量分析，但不能分辨转录物来源于哪个肿瘤细胞。为了检测细胞来源和对转录物进行量化分析，可以利用激光捕获显微切割结合定量RT-PCR，检測血管瘤特定区域的基因表达水平(Calicchio等，2009)通过这些方法对血管瘤增殖期、消退期、消退完成期的切片进行检测，获得了对血管瘤周期的新的见解。这里列举了几个例子，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)是一种血管生成趋化因子，在增殖期含量增加且已定位在血管周围、平滑肌肌动蛋白(-SMA)阳性细胞和血管瘤中的巨噬细胞(Isik等，1996)，有报道称.同源盒转录因子家族成员HOXD3在血管痛增殖期中表达水平增加(Hansen等，2006)。在血管各阶段的血管内皮细胞中检测到同种异体爽症因子1.也表明这是可用的肿瘤标志物(Jia等，2008)。此外，在血管瘤中检测到缺氧诱导因子1(HIF-1)和缺氧诱导因子2(HIF-2)的表达。近期，在增殖期血管面内皮细胞中检测到SKI致癌基因，它可以抑制转化生长因子(TGF)-B信号通路，刺激Wnt/B-联蛋白信号通路(O等，2009)。

血管免疫组织化学染色显示，在缺乏明显的血管或管腔结构的致密细胞区域内的早期病变中，内皮细胞标志物有一种非结构化的染色模式，这些标志物包括血管性血友病因子(Takahashi等，1994)CD31/PECAM-1、VEGFR-2(Yu等，2004)和TIE2(Yu等，2001)(图3-3C和图3-8B，C)。据报道，CD34也有类似的无血管相关的模式(Smoller和Apfelberg，1993)，其是一种在微血管内皮细胞以及内皮和造血祖细胞上表达的细胞表面蛋白聚糖，但在淋巴管内皮细胞中不表达(Hirakawa等，2003)根据免疫染色，发现细胞内黏附分子-3(ICAM-3)在增殖的血管瘤中高度表达，但在消退期血管瘤中分化良好的血管内含量较低，甚至没有(Verkarre等，1999)。这与假设中I-CAM-3在早期血管形成中的作用相一致。在细胞亚群中可以检测到人干细胞/祖细胞标志物CD133，但并不局限于血管的管腔表面(Yu等，2004；Boscolo和Bischoff，2009)(图3-8A)随着增殖期的结束，CD31/PECAM-1、血管性血友病因子、VEGFR-2和TIE2明显位于血管内的内皮细胞上，提示内皮细胞分化和血管形态的发生(图3-4C)。根据这些研究推测，尚未形成血管结构的CD34*、TIE2*和VEGFR-2*细胞可能是内皮祖细胞(EPC)。确实，我们成功地在增殖期血管剂中整定出共表达肝细胞标志物CD133和内皮细胞标志物VEGFR-2戒CD34的细胞(Yu等，2004)(图3-8D)。干细胞标志物和内皮细胞标志物在相同细胞中的共表达，为增殖期血管瘤中存在未成熟内皮细胞或EPC提供了强有力的证据，根据这些研究发现，我们推测血管榴中的CD133*祖细胞分化成为内皮细腿、这些内皮细胞分布在消退期的血管内。血管指腔内的内皮细胞表达成熟的标志物，如VE-钙黏蛋白(一种同型性内皮黏附分子)(Mar-tin-Padura等，1995)和血管性血友病因子(Taka-hashi等，1994；Tan等，2000)内皮细胞还可以结合植物荆豆凝集素(Li等，2003)。血管指血管还表达E-选择素(Kraling等，1996)。最近有研究证明，内皮细胞可从增殖期的血管瘤中分离出。通过a平滑肌肌动蛋白(x-SMA)(Takahashi等，1994)、人周细胞标志物NG-2和CD146(Li等，2003；Boseolo和Bischoff.2009)染色阳性结果显示，内皮细胞衬里的血管周围有周细胞可作为内皮细胞成熟的进一步证据(图3-9)LYVE-1是在淋巴管内皮细胞表达的透明质酸受体，在增殖期血管中高表达，但在消退期血管瘤中表达量较低甚至不表达(Dadras等，2004)。然而，在同期研究中使用相同的抗体，尽管在血管肉瘤和卡波西肉瘤中可检测到LYVE-1，但并未在血管瘤或其他良性血管病变中检测到(Xu等，2004)。这些矛盾的研究结果强调了采用多种技术检测蛋白质和mRNA水平表达的重要性。

通过免疫组织化学在增殖期血管瘤中检测到两种有效的血管生成肽：血管内皮细胞生长因子A(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，这两种生长因子在消退期和消退完成期含量下降(Takahashi等，1994；Tan等，2000)。有研究证明，在增殖期血管瘤中发现VEGFmRNA(Chang等，1999)，但在其他研究中，在增殖期或消退期的血管组织标本中VEGFmRNA表达水平不高(Yu等，2001；Ritter等，2002)。研究发现，相比于清退期，儿童血管的增殖期血清中检测到VEGF-A表达水平较高(Kleinman等，2007；Przewratil等，2009)；在皮质类固醇治疗后降低(Zhang等，2005)，提示VEGF-A可能从血管中释放。一些研究试图找出血管瘤中VEGF-A和bFGF米源的细胞，有人推测VEGF-A和bFGF来源于巨磁细胞或肥大细胞(Qu等，1995；Grutzkau等，1998)。血小板被认为是刺激肿瘤血管生成的重要物质，在其中也发挥作用(Pinedo等，1998)。Berard及其同事(1997)利用基质细胞进行体外实验，检测到VEGF-A生成。相比之下，通过RNA印迹法(Yu等，2001)从血管瘤分离出的内皮细胞VEGF-A低表达[实时定量PCR和联免疫吸附测定(ELISA)](Greenberger等，2010)，而早期血管来源的多能干细胞(HemSC)中VEGF-A高表达。通过免疫荧光双标记技术，检测到VEGF-A阳性的细胞在内皮区之外，与位于增殖期血管瘤基质部分的干细胞一致，是VEGF-A的细胞来源(图3-11)。

已知在增殖期中含量上升的蛋白质，如Ⅳ型胶原酶、尿激酶和其他蛋白酶参与了血管发育期间细胞外基质的重塑(Takahashi等，1994)。这些酶的底物Ⅳ型胶原，层粘连蛋白、纤连蛋白和玻连蛋白在血管痛的各期都位于基质中(Martin-Padura等，1995；Jang等，1998；Tan等，2000)，相比于增殖期的血管留，玻连蛋白在消退期的血管瘤中含量减少(Jang等，1998)。据此推测，Ⅳ型胶原酶蛋白水解和随后尿激爵蛋白水解为毛细血管网的形成提供了空间(Takahashi等，1994)，对患血管瘤的婴儿进行尿液检测发现，高分子最的金属蛋白南在统计学上显著增加，表明这些两在血管瘤的发生中起一定作用(Marler等，2005)。在血管瘤消退期检测到抑制新血管生成的组织金属蛋白丽抑制剂(TIMP1)，但在增殖期早期并未发现(Takahashi等，1994)。TIMP1染色发现其主要位于微血管周围周细胞的细胞质中(图3-12)。TIMP1可以抑制金属蛋白酶，包括基底膜胶原酶如Ⅳ型胶原酶(义被称作明胶丽A和B)，这是一种内皮细胞人侵的抑制因子和血管发生的负调节因子(Takahashi等，1994)

相比于原位杂交或PCR检测候选mRNA，基于微阵列的转录谱偏差较小且更为全面。通过微阵列可以分析34000个转录物，包括人类基因组。针对某些特定基因的芯片已经商业化，能靶向检查基因表达。血管的分子基础使得不同的mRNA得以表达。在基因原发缺陷发生的下游可以提出至少3种可能的变化，一种是对于原发缺陷的发生做出开启或关闭反应，并且直接影响血管生成或者调节血管生成的基因。一种是因原发缺陷上调或下调的基因，在血管箱发生中是旁观者，无直接作用。还有一种是对血管瘤发生和肿瘤生长无明显作用的基因，但对于婴儿其他方面可能导致严重损伤，如诱导3型碘代甲状原氨酸脱碘酶生成，可导致甲状腺功能减退(Huang等，2000)。几个小组对以下几个方面转录结果进行了报道：①增殖与消退期血管：②血管锦组织与其他人体组织；③血管瘤内皮与胎盘内皮。第一个微阵列研究显示，在增殖期的血管瘤内，胰岛素样生长因子2(IGF2)高表达。此外，内皮标志物CD31、CD34，-v/B-3整合素和Ⅳ型胶原的转录物在增殖期的血管瘤中聚集。我们还利用基因微阵列在血管瘤中找到表达水平较高的IGF2转录物，并且发现IGF2蛋白错定在血管瘤间质中的细胞上和血管内的细胞上(图3-13)(Yu等，2004)。位于染色体11p15的人IGF2基因编码有关胚胎和出生后生长的促有丝分裂生长因子，在大多数正常人组织中，IGF2仪从父系等位基因转录而来，是一种单等位基因表达的方式(Giannoukakis等，1993)。IGF2印迹的丧失与儿童各种肿瘤中的IGF2过表达有关，我们提出了这是否也在血管榴中发生的疑问。研究结果表明，血管痛中IGF2表达水平增加井不是由于印迹的丧失以及随后的双等位基因表达引起的，在15/15个样本中均发现单等位基因的表达(Yu等，2004)。到目前为止，尽管在几个研究中发现IGF2，但几乎没有研究描述其在血管瘤发生中的作用。Ritter及其同事进一步对增殖期、消退早期(“平台期“)和消退期的血管蘿进行微阵列分析，对上调和下调的基因进行分类(Ritter等，2003)。他们发现，在上调的基因中有两组转录物编码酶相关基因和免疫相关基因突出表达，例如编码吲哚胺2.3-双加氧酶(IDO)的mRNA在增殖期显著增加而在消退期减少。IDO是降解色氨酸的一种酶，而色氨酸对丁细胞功能至关重要，Ritter及其同事推测，增殖期IDO高表达，抑制T细胞的功能，从而减少免疫介导的对血管的抑制。为了验证他们的假设，在血管瘤的各阶段中均检测到CD8细胞毒性丁细胞(Ritter等，2003)。免疫细胞的作用以及其活性如何在血管发生过程中的不同时间点受到微环境的调节，是进一步研究的重要领域。Bames及其同事(2005)利用分层聚类法和非分层聚类法对血管瘤和人体其他组织进行了全基因组转录谱分析。研究结果表明，血管瘤和胎盘的全基因转录谱之间有很明显的相似性，为胎盘细胞产生血管编的假说提供了证据。