脉管性疾病细胞研究

显微切割Calicchio及其同事(2009)利用另一种方法鉴别内皮细胞在增殖期和消退期基因表达模式的差异。他们利用激光捕获显微切割的方法从血管瘤组织切片内皮细胞中分离出RNA，对这些细胞从增殖期到消退期的转录情况进行研究，并与胎盘血管进行比较，发现存在显著差异与胎盘内皮细胞相比，增殖期血管内皮细胞中促血管发生的Noteh配体JACCED-1(Benedito等，2009)表达上调了6倍(Caliechio等，2009)。血管生成素2和Notch4的表达也有所上调，血管生成素2表达明显上调(约33倍)，与先前报道一致的是，VEGF-受体1(也称为Fl-1)在血管痛中表达减少(Jinnin等，2008；Pieard等，2008)。族集素基因参与调亡，有研究发现，它在消退期血管瘤中表达上调(Hasan等，2000)。综上所述，通过激光捕获显微切制法从增殖期血管瘤和消退期血管瘤选择性分离内皮细胞印证了先前的发现，提供了新的线索，为血管细的进一步研究奠定了基础。

利用从血管痛中分离出的特定细胞进行体外未发现HemEC中存在TIE2突变。血管瘤来源的内皮祖细胞基于我们的早期研究(Yu等，2004)，我们在婴儿增殖期血管瘤中选择共表达人干细胞标记CD133和一种内皮标记的细胞，并分离出这些细胞作为HemEC的可能前体细胞，我们称之为血管来源的内皮祖细胞(HemEPC)(Khan等，2006)。HemEPC可能是HemEC的前体细胞，我们推测这两个细胞群在细胞培养中测定的结果应该相似，为了验证这一假设，我们对HemEPC和HemEC的生长、迁移、黏附以及对血管生成抑制剂内皮抑制素的反应进行了检测(O*Reilly等，1997)。曾有研究表明，利用内皮抑制素预处理HemEC，可以刺激其迁移(Boye等，2001)，这与内皮抑制素对成年人内皮细胞迁移的抑制效应相反(Yamaguchi等，1999)。HemEPC与HemEC的相同之处是都可以被内皮抑制素刺激，说明两种细胞有相同表型，但意想不到的是，分离出的正常脐带血来源的内皮祖细胞也有相似的表型，这些从脐带血中分离的原代内皮细胞是初期内皮细胞的原形，综上所述，HemEPC，HemEC和脐带血内皮祖细胞在体外实验包括细胞-细胞和细胞-基质黏附分子的mRNA转录谱中有相似性(Khan等，2006)。我们得出结论，HemEPC和HemEC是不成熟的内皮祖细胞，且与脐带血内皮细胞具有相似的特征。这个研究扩展井确定了Dosanjh(2000年)提出的观念，HemEC以及HemEPC可以与完全成熟的新生儿皮肤微血管内皮细胞区分开。这些发现提出了关于循环内皮祖细胞是否在增殖期IH中聚集的问题，如果有聚集，它们是否可以促进肿瘤生长？为了验证这一问题，Kleinman及其同事(2003)研究发现，在儿童血管瘤中，循环CD133/CD34*细胞数量增加。然而，他们研究的患者年龄(平均38个月)相对于婴幼儿血管患者(平均25个月)较大。循环祖细胞的水平在婴儿期和儿童早期有所变化，因此重要的是在大量匹配度更高的实验中重复研究，从而验证婴幼儿血管瘤中循环祖细胞的增多量。

我们将HemEC和HemEPC植人裸鼠体内建立动物模型并测量血管瘤来源的血管，发现HemEC和HemEPC不生成血管(Khan等，2008)。因此，我们考虑在血管瘤增殖期分化的细胞更少，类似于一直以来提出的原始血管祖细胞，是否能够在体内形成血管瘤样的GLUTI阳性血管。为了确定这一假设，我们从血管痛中分离出CD133阳性细胞，但不进行第2次内皮细胞筛选。根据这种方法，我们在超过30个增殖期血管瘤样本中找到了一种多能干细胞，并将其称之为血管瘤来源的干细胞(HemSC)(Khan等，2008)。HemSC有强大的增殖潜能和多向分化潜能，这是干细胞的两个重要特征。HemSC不表达CD31/PECAM-I或VE-钙黏蛋白，与内皮细胞相反的是，HemSC表达CD90(一种间充质细胞标志物)。因此，HemSC在表型上更类似于间充质细胞而不是内皮细胞。将HemSC植人免疫缺陷的裸鼠后，形成GLUT1阳性的血管痛样血管和脂肪细胞(Khan等，2008)。在体外实验中，可以利用特异性细胞培养基去诱导HemSC分化成内皮细胞或脂肪细胞(Khan等，2008)。内皮细胞分化需要VEGFR-1，还需要血管榴组织中的配体如VECF-A或VECF-B的刺激(Boscolo等，2011a)，在裸鼠模型和在体外将HemSC与内皮细胞共培养的实验中，我们证明HemSC可以分化成周细胞(Boscolo等，2011b)(图3-15)。Calicchio及其同事发现，周细胞分化由Notch配体JAGGEDI驱动，该配体在增殖期内皮细胞中表达水平上调(Cal-iechin等，2009)。

在小鼠模型中，阻断HemSC向周细胞分化的过程后就没有生成血管瘤样血管，说明血管瘤发生需要周细胞分化。于是我们从增殖期和消退期血管中分离周细胞，用来研究它们的性质。与消退期血管瘤中的周细胞和正常的周细胞相比，增殖期血管瘤中的周细胞在体外生长速度较快、收缩活性降低且血管生成素1表达量较低(Buscolo等，2013)。有研究表明，血管生成素1在小鼠损伤或微血管应激中有抑制血管生成的作用(Jeansson等，2011)，这也表明增殖期血管周细胞中血管生成素1相对缺乏，有利于新血管暴发性生长。

Tan及其同事(2000)建立了离体模型，将血管扁样本在两个纤维蛋白凝胶盘中培养。这个模型的优点在于，所有已知和未知构成血管瘤的细胞均可以存在于外植体中。3~6天后，细胞生长，通过细胞特异性标志物的免疫染色可以确定细胞表型，以确定在外植体中迁移或增殖的细胞类型。这个模型利用外植体可以证明血管榴整个胞谱系对于外源性因子的应答反应。

基于细胞的小鼠血管瘤模型从血管痛样本中分离HemSC培养扩增成细胞群，在体内测试其形成血管烟样GLUTI阳性肿瘤的能力。将细胞群植人到免疫缺陷小鼠的皮下，7-14天后发现有人CD31/GLUTI阳性微血管生成(Khan等，2008)。可以分离出在体内分化为内皮的HemSC井植人二次受者小鼠皮下，可以再次形成血管。在这个动物模型中，人类其他几种细胞包括HemEC.HemEPC、脐带血内皮祖细胞、正常人成纤维细胞和来源于骨髓的间充质干细胞都不能再次形成血管，这种生成血管的潜在能力是HemSC特有的。随着时间推移，小鼠模型中人类血管生成减少，脂肪细胞显著增生，这个过程类似于血管瘤消退期，用绿色荧光蛋白(GFP)标记HemSC进行跟踪，显示HemSC在体内先形成血管，之后分化为脂肪细胞。图3-15描述了HemSC在体内和体外形成内皮细胞和分化成脂肪细胞的潜力。运用类似的方法，我们发现HemSC在体内和体外还可以分化成周细胞(Boscolo等，2011)(图3-15)。综上所述，我们认为HemSC是血管三种主要细胞类型的前体细胞。

为进一步阐明血管瘤干细胞在血管指发生中的作用，我们研究了皮质类固醇的治疗对HemSC和血管熘源性内皮细胞(HemEC)的影响。在体外，皮质类固醇对HemEC的增殖没有影响，除非应用远高于治疗剂量的皮质类固醇，但在0.2pM和2.0pM的低剂量下可以显著下调VEGF-AmRNA和蛋白质的合成(Greenberger等，2010)。用皮质类固醇预处理HemSC后植人小鼠，可以阻断它们生成血管的能力，为了验证皮质类醇对HemSC作用的靶点是否是VEGF-A，我们利用发夹RNA干扰HemSC中VEGF-A的表达。对VECF-A的特异性干扰，可以降低体内血管生成活性(Greenberger等，2010)。相比之下，HemEC和HemEPC中VEGF-A表达量较低，且产生的其他化合物不受皮质类固醇的影响(图3-16)。这些实验验证了我们先前的猜测，HemSC在血管瘤发生中有重要促进作用。进一步研究皮质类固醇使VEGF-A及其他靶点如MCP-1JL-6和UPAR表达减少的机制，由于这些因子都是由核因子活化B细胞k轻链增强子(NF-kB)诱导产生的，因此我们检测了NF-kB的活性。结果表明，地塞米松(皮质类固醇的一种)降低了HemSC中的NF-kB活性(Greenberger等，2010)，这个发现有利于进一步了解皮质类固醇是如何影响血管熘发生的。

皮质类固醇和善茶洛尔是血管痛的主要治疗药物，但对这两种药物无效的儿童，仍需要新的治疗方法。皮质类固醇可以下调VECF-A的表达量，但不影响血管干细胞(HemSC)的增殖。我们筛选了可以抑制其增殖的化学药物，发现雷帕霉素(一种mTOR抑制剂)可以抑制HemSC增殖，但对正常人间充质干细胞或成纤维细胞的增殖无影响(Greenberger等，2011)。我们分别在体内和体外检洲雷帕霉素对血管瘤来源干细胞的作用。雷帕霉素对HemSC的自我更新能力的抑制作用不可逆，并促进其向成熟间充质表型分化。雷帕霉素对HemSC的VEGF-A表达水平几乎没有作用，但将HemSC植人免疫缺陷的小鼠后，雷帕霉素可以阻断其形成血管的能力。这些作用机制不重叠，所以我们用低剂量的雷帕霉素和地塞米松联合用药，可以有效地阻止小鼠模型中血管生成。我们认为，雷帕霉素可以作为治疗高风险血管瘤的新选择。据我们所知，HemSC是出生后唯一可以在体内形成功能性血管的细胞。我们及其他研究者发现，用正常人内皮细胞快速构建实质性血管网需要间充质细胞的支持(Melero-Martin等，2008：Au等，2008；Fou-bert等，2008)。因此，在没有间充质细胞的条件下，HemSC是一种具有在体内形成血管能力的细胞。已有研究证明，HemSC在体外和体内分化为HemEC(Khan等，2008)，在与内皮细胞接触后可分化为周细胞(Boscolo等，2011b)。问题在于，出生后干细胞的环境紊乱(外源性缺陷)是否会导致婴幼儿血管瘤的发生，或者HemSC的遗传改变(内在缺陷)是否可以引起局部血管异常生成和脂肪形成。

血管瘤周期3个阶段的组织学、超微结构和细胞生物学研究，为理解其发病机制提供了思路。如果婴幼儿血管是由于内皮细胞生长和分化紊乱引起的，问题就在于是什么形式的紊乱？细胞增殖的增加可能正常血管的分化和形态变化理论上这些细胞增殖可能的原因是：①外源因素，即有丝分裂刺激物质过量或抑制因子的缺乏；2细胞克隆的内在缺陷。