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血管瘤论坛 血管瘤的生物特性 姜黄素对血管瘤内皮细胞凋亡的诱导作用及对Bcl-2和Bax蛋白表达的调控 ... ...

姜黄素对血管瘤内皮细胞凋亡的诱导作用及对Bcl-2和Bax蛋白表达的调控 ... ...

发布者: 血管瘤论坛   2020-4-8 10:48   127  

 徐卫东,沈晓冬(江西中医学院附属医院,江西南昌330005)

       摘要:目的:研究姜黄素对血管瘤内皮细胞凋亡的影响。方法:在培养液体系中加入不同浓度的姜黄素进行不同时间长度的诱导,以MTT法检测细胞增殖,流式细胞术,TUNEL法检测细胞凋亡情况,Westernblotting分析Bcl-2和Caspase-9蛋白表达。结果:1~50μmol/姜黄素均能抑制血管瘤内皮细胞增殖。5、10、50μmol/L姜黄素作用细胞4天后的凋亡率分别为(11.98±2.13)%、(17.96±1.25)%、(26.86±2.08)%,与对照组(4.03±1.16)%比较差异均有显著性意义(均P<0.05)。姜黄素浓度越高,诱导凋亡作用越明显,呈明显的剂量依赖效应。50μmol/L姜黄素作用细胞1、2、3、4天后的凋亡率分别为(6.93±1.06)%、(10.15±1.35)%、(17.21±2.06)%、(26.83±2.02)%,与对照组(3.98±1.03)%比较差异均有显著性意义(均P<0.05)。姜黄素作用时间越长,抑制血管瘤内皮细胞增殖作用和诱导凋亡的作用也越明显,呈明显的时间依赖效应。同时姜黄素浓度越大、作用时间越长,血管瘤内皮细胞细胞中Bcl-2蛋白的表达明显减少,而Caspase-9蛋白的表达明显增加。结论:姜黄素能够抑制血管瘤内皮细胞增殖、诱导血管瘤内皮细胞发生凋亡,并呈时间和剂量依赖效应,可能是通过下调凋亡抑制基因bcl-2表达,上调Caspase-9表达而实现的。

       关键词:姜黄素;血管瘤内皮细胞;细胞凋亡;bcl-2;caspase-9

       血管瘤是一种常见的良性皮肤肿瘤,是皮肤血管异常增生或血管扩张,所引起各种血管瘤及血管胎记。一般不会造成生命上的危险,但若发生于头、脸、颈部,常因此造成患者外观上的困扰。但如果长在五官,且影响到幼儿的视力、听力、吸吮等功能或感染、溃疡、流血不止时,就会影响患者的生存质量甚至生命。但这些严重血管瘤至今仍旧没有很理想的治疗方法。中医药治疗血管瘤有很长的历史,也有很好的临床效果。姜黄素(curcumin,CUR)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术等的根茎中提取的一种有效成分。其分子式为C21H20O6,分子量是368.38,是植物界很稀少的具有二酮的色素,为二酮类化合物。姜黄素可溶于甲醇等有机溶剂,在水中溶解度低。姜黄素为橙黄色结晶粉末,味稍苦,不溶于水。医学研究表明,姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用,临床上也用于治疗血管瘤。然而姜黄素对血管瘤内皮细胞影响的报道较少,本研究采用流式细胞仪等先进的免疫学技术,观察姜黄素对增殖、凋亡、及凋亡相关蛋白的影响,从而为其开发成治疗血管瘤的药物提供一些理论支持。

       1材料和方法

       1.1实验材料

       血管瘤内皮细胞(LSC),获得自浙江大学病理系(细胞源自美国ATCC细胞库),为本实验室冻存;姜黄素购至美国sigma公司;RPMI1640培养液为Gibco公司产品,胎牛血清为杭州四季青公司产品,MTT、二甲基亚砜(DMSO)购自武汉大风生物技术公司,Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒购自公司,原位细胞凋亡检测试剂盒为Roche公司产品;Bcl-2、Caspase-9单克隆抗体购自深圳晶美生物技术有限公司。主要仪器包括ELX2800UV型酶标测试仪、流式细胞仪(Beckmancoulter)。

       1.2细胞培养和条件

       采用不同作用时间(24~96h)和不同浓度(10~200μg/mL)姜黄素对血管瘤内皮细胞进行作用。LSC细胞常规培养于25mL培养瓶中,培养液为含10%FBS,100U/mL青霉素和链霉素的RP2MI1640,置于37℃、5%CO2、湿度95%的恒温细胞培养箱中。

       1.3细胞增殖测定

       采用MTT法。细胞消化后培养在96孔板,每孔加细胞1000个。实验设1、5、10、50μmol/姜黄素作用组和空白对照组,共5组,分别于细胞接种后36h加药,然后分别在加药后第1、2、3、4天取出1块96孔板,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,37℃孵育4h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μL的DMSO,振荡10min。选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值,记录结果,并计算生长抑制率。生长抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

       1.4流式细胞仪检测细胞凋亡

       分别以5、10、50μmol/L的姜黄素作用对数生长期的细胞,设空白对照组,4天后进行流式细胞术检测。以50μmol/L的姜黄素分别作用对数生长期细胞,分别于1、2、3、4天后进行流式细胞术检测,并设空白对照组。调整待测细胞密度为5×105~1×106个/mL;取1mL细胞,1000r/min、4℃离心10min,弃上清;加入1mL冷的PBS,轻轻振荡使细胞悬浮;1000r/min、4℃离心10min,弃上清;重复离心2次;将细胞悬浮于200μL结合缓冲液;加入10μLAnnexin-V-FITC和5μLPI,轻轻摇匀避光室温反应15min;加入500μL结合缓冲液,立即上机检测。

       1.5原位缺口末端标记法

       检测细胞凋亡将细胞接种于4块1.2cm×1.2cm的玻片,分别以0、5、10、50μmol/L的姜黄素作用细胞4天后取3张玻片进行检测。按原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作,以无末端转移酶的标记液代替TUNEL复合物作阴性对照,以细胞核呈明显的棕黄色为阳性染色,每张玻片随机选择10个高倍视野(×400),计算阳性细胞的百分数,即为细胞凋亡指数。1.6Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的Westernblot-ting分析用蛋白裂解液提取各组血管瘤内皮细胞的总蛋白,用Bradford法测定蛋白浓度,Westernblotting法分析目的蛋白的表达情况。1.7统计学分析数据用SPSS12.0软件进行数据统计分析。

       2结果

       2.1MTT法

       测定细胞生长抑制姜黄素对血管瘤内皮细胞生长有抑制作用,并呈时间和剂量依赖关系,最高抑制率达42.47%,4组实验组与对照组比较在第4天时差异均有显著性意义(均P<0.05)。见表。

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       2.2流式细胞仪

       检测细胞凋亡检测结果提示姜黄素能够诱导血管瘤内皮细胞凋亡,并且呈时间和剂量依赖效应,不同浓度药物组与对照组比较在作用4天后差异均有显著性意义(均P<0.05),50μmol/姜黄素作用1、2、3、4天后与对照组比较差异均有显著性意义(均P<0.05),见表。

       2.3TUNEL法检测细胞凋亡细胞核中有棕黄色着色颗粒者,为凋亡细胞。实验结果提示姜黄素作用组的凋亡细胞明显多于对照组,而且随着ATRA浓度的增加,凋亡细胞数也增加(图1,表5)。


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       2.4血管瘤内皮细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白的表达见表6和图1。

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       3讨论

       细胞凋亡是多细胞有机体为了调控机体发育,维护内环境稳定,由基因控制的细胞主动死亡过程。细胞凋亡参与机体许多病理生理过程。bcl-2基因家族在控制细胞凋亡过程中起着重要的作用,该家族包括抑制凋亡的基因bcl-2和bcl-xL,以及促进凋亡基因bax和bad。它们具有同源的氨基酸序列。bax的过表达已经证明可以促进细胞的死亡,然而,抑制细胞凋亡蛋白质(如bcl22)的过表达则可以抑制bax引起的细胞凋亡的功能。Caspase家族是执行细胞凋亡的关键酶家族,Caspase-9作为其中一员,属于该家族的凋亡起始组,其活化可以激活凋亡效应组的Caspase-3和Caspase-7,从而诱导细胞凋亡。而Caspase-3和Caspase-9之间存在正反馈效应,可使细胞凋亡加速。血管内皮细胞的增殖与凋亡是维持血管内径的重要因素,这种平衡的打破,就会导致血管的畸形。姜黄素(curcumin,CUR)是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术等的根茎中提取的一种有效成分。其分子式为C21H20O6,分子量是368.38。大量研究表明,姜黄素对多种肿瘤有抑制作用,如肝癌、胃癌、大肠癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、淋巴瘤及白血病等。姜黄素能影响肿瘤发生发展的多个环节与步骤,如诱导肿瘤细胞凋亡、抑制癌基因表达、抗肿瘤侵袭和转移、抑制肿瘤血管生成、以及增加肿瘤细胞对化疗的敏感性等。姜黄素诱导细胞凋亡的途径主要有线粒体途径、p53途径、Bcl-2家族蛋白途径等。姜黄素能通过线粒体途径诱导细胞凋亡,它可诱发细胞色素C和一些凋亡诱导因子的释放,促进细胞凋亡。Bc1-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。Radhakrishna等在研究姜黄素诱导肺癌细胞凋亡的机制中发现,姜黄素可使抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-X(L)下调。本研究证实姜黄素可以在体外以剂量依赖性和时间依赖性的方式诱导血管瘤内皮细胞发生凋亡。这种凋亡可能是下调凋亡抑制基因bcl-2表达,上调Caspase-9表达,但其过更近一步的作用机制还尚需更深入的研究。


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