刘斌，赵怡芳，张文峰 (武汉大学口腔医学院,武汉430079) [摘要]目的观察接受和未接受平阳霉素治疗的淋巴管畸形中VEGF C和VEGFR-3表达，探讨平阳霉素治疗淋巴管畸形的机制。方法 收集20例接受平阳霉素治疗的淋巴管畸形标本及10例未接受治疗的标本做组织学观察以及免疫组织化学研究,评价形态学变化并分析VEGF c和VEGFR-3表达是否存在差异。结果 两组病变VEGF-C和VEGFR-3表达有显著性差异(P<0.05),并且VEGF-C和VEGFR-3表达有相关性。结论平阳霉素注射治疗淋巴管畸形的分子机制可能是通过抑制VEGF c VECFR-3 系统的信号传导从而达到治疗淋巴管畸形的目的。 [关键词]平阳霉素;淋巴管畸形; VEGF- C; VEGFR-3 淋巴管畸形是一种淋巴系统的先天性发育畸形,外科手术是其主要治疗方法。然而，累及范围广泛的病变手术切除不易彻底,而且切除后可能导致严重的并发症，因此人们把目光投向探索有效的非手术治疗。近年来,平阳霉素的使用越来越受到重视。但其治疗淋巴管畸形的分子机制仍然不清。本研究应用免疫组织化学方法分析正常淋巴管、淋巴管畸形及经平阳裤素治疗后的淋巴管畸形中血管内皮生长因子及其受体的表达并观察血管内皮生长因子C(vascular enohelial growth factor e, VEGF-C)及血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growh factor receptor 3, VEGFR- 3)的表达水平与平阳霉素硬化治疗的关系，以探讨平阳霉素治疗淋巴管畸形的机制。 1材料和方法 1.1病例选择本实验标本来自2000年5月至2001年5月间本院门诊及住院部治疗的淋巴管畸形病例(年龄从4岁~22岁),其中20例接受病变内注射平阳霉素治疗,10例未接受平阳霉素治疗。 1.2 主要用药及试剂平阳霉素(PYM),为天津市河北制药厂产品,8mg/支。 VEGF-C及VEGFR-3免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.3 HE染色标本以10%甲醛固定,流水冲洗,行梯度乙醇脱水、透明浸蜡、包埋、切片、HE染色、光镜下观察。 1.4 SABC法 载玻片的防脱片处理后石蜡切片常规脱蜡至水。蒸馏水新鲜配置,3%H2O2,室温5~ 10min以灭活内源性酶，蒸馏水冲洗2minx3次;用复合消化液室温处理切片20min以暴露抗原,0.1MPBS洗涤2minx3次;滴加正常血清封闭液(VEGF-C为免血清, VEGFR-3为山羊血清),室温孵育20min,甩去多余液体,不洗;滴加适当的一抗(VEGF-C 为山羊抗人IgG,VEGFR-3为免抗人IgG),37C1-2 h或4C过夜,0.1MPBS洗涤2minx3次;滴加生物化素二抗,379C 20min,0.1M PBS洗2minx3次;滴加试剂SABC,37C 20min,0.1M PBS洗5minx4次;DAB显色;苏木精复染脱水透明,中性树胶封片。用PBS液代替一抗作空白对照;VEGF-C阳性对照:血管瘤;VEGFR-3阳性对照结肠癌。 1.5 图像分析先在低倍镜下浏览全片,找到病变区，换高倍镜(x100倍)每张切片选取5个视野(不重叠、不重复)以求观测平均值。应用北航图像分析软件读取选定区内组织的灰度值,灰度值越小,说明阳性反应程度越强，它们的均值为平均灰度值。 1.6统计学处理 结果用SPSS 10.0软件进行统计学分析。 2结果 2.1 组织学观察注射平阳霉素后镜下见管腔缩小，有成纤维细胞增生,管腔间及管壁胶原纤维增多,管腔间组织有较多淋巴细胞浸润(图1);有些管腔连续性不完整(图2)。
图1大量淋巴细胞漫润、管腔及管周组织纤维化(HE,2.5x10)
图2病变管腔连续性不完整(HE,2.5x20) 2.2 VEGF-C 和VEGFR-3免疫组化染色未治疗组中VEGF-C在淋巴管内皮细胞中有阳性表达，表达产物为棕黄色颗粒状，主要位于细胞浆内。间质中平滑肌细胞和纤维细胞有弱阳性表达,偶可见少量淋巴细胞弱表达(图3);接受治疗组中VEGF-C在淋巴管内皮细胞的表达明显减弱(图4)。
图3来治疗的淋巴管畸形VEGF-C阳性着色
图4接受治疗的淋巴管畸形VEGF-C阳性着色较弱(SABC, 2.5x40) (SABC, 2.5x40) 未治疗组中VEGFR-3在淋巴管内皮细胞中强表达,表达位于细胞浆及细胞膜,产物为棕黄色颗粒状,镜下呈现为连续的黄线,间质中平滑肌细胞和纤维细胞有弱阳性表达(图5);接受治疗组中VEGFR-3在淋巴管内皮细胞中有弱阳性表达(图6)。
图5未治疗的淋巴管畸形VEGFR-3强阳性着色，呈现为连续的黄线(SABC, 2.5x40)
图6接受治疗的淋巴管畸形VEGFR-3阳性着色较弱 (SABC, 2.5x40) 2.3染色结果分析VECF-C 和VECFR-3染色的平均灰度直在未治疗的淋巴管畸形、接受治疗的淋巴管畸形两者之间有显著性差异(P < 0.05 ,表1),并且在未治疗的淋巴管畸形和接受治疗的淋巴管畸形的VEGF-C和VEGFR-3染色表达均星正的直线相关(P< 0.05)。 表1两种情况下VEGF-C和vEGFR-3染色平均灰度值比较
平阳霉素 是从平阳链球(sreptomycin pngangnsien,n SP)产生的15种博莱霉素组分中筛选出的抗肿维抗生素,其成分与bleomycin A5相似。注射平阳霉素后,组织病理学观察到纤维化现象以及淋巴细胞浸润，可以推断平阳霉素的治疗机理可能是:抑制淋巴管内皮细胞生长，甚至直接导致细胞坏死变性;作为一种化学物质,易引起局部组织炎性反应,导致成纤维细胞增生,间质纤维化。 VEGF-C是VEGF家族的一个成员,又称为VRP(VEGF-related protein),可与VEGF- c与VEGFR-2的结合有促血管生长作用，与VEGFR-3的结合却与淋巴管的生长有紧密关系。VEGF受体家族属于酪氨酸激酶受体家族第三亚型，由三种酪氨酸激酶跨膜受体组成，即VEGFR-1(FIt-1)、VEGFR - 2(KDR/FIk -1)和VEGFR-3(Flt-4) 。VECFR-1和VEGFR-2分别参与血管发育的不同阶段,而VEGFR 3FTt 4在淋巴管发育中起着重要作用，其配体是VEGF-C和VEGF-D。此外，研究显示,VEGFR-3/FTt-4在胚胎时期存在于血管母细胞、中胚层成血管细胞和胚胎静脉内皮细胞,随着细胞分化，最后局限于淋巴管内皮细胞中。 Kukk等同报道在鼠胚胎淋巴管发育的过程中VEGFR-3的表达与其配体VEGF-C相关,提示可能是VEGF-C通过旁分泌的方式作用于表达VEGFR-3的内皮细胞;这种表达模式说明,VEGF-C VEGFR-3在淋巴系统的发生中起着重要作用,VEGF-C的淋巴管内皮生长信号是通过VEGFR-3转导。本研究发现,淋巴管畸形中VEGF-C在淋巴管内皮细胞胞浆有阳性表达,VEGFR-3在淋巴管内皮细胞的胞浆及胞膜强阳性表达。同时在淋巴管畸形中两者表达有相关性。这显示VEGF-C-VEGFR-3系统在淋巴管畸形发病中有着不可忽视的作用,淋巴管畸形可能是VEGF-C-VEGFR-3生长信号过强表达的结果。 同时，研究中显示,VEGF-C和VEGFR-3的表达在未接受平阳霉素治疗和接受治疗的病变两者之间存在差异性,接受治疗的表达明显弱于未接受治疗的表达,并且VEGF-C和VEGFR-3在两种情况下的染色表达均存在相关性。因此可以推断该疗法的分子机制可能是:平阳霉素可降低两者的表达水平，同时可能阻止两者的结合,从而阻断了淋巴管内皮细胞生长信号的传递淋巴管内皮细胞缺乏信号刺激后分泌停止、逐渐衰亡;其最终被成纤维细胞替代而使病变区纤维化。 |
