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血管瘤论坛 血管瘤的临床应用 细胞注射法和组织块移植法在构建血管瘤动物模型中的比较

细胞注射法和组织块移植法在构建血管瘤动物模型中的比较

发布者: 血管瘤论坛   2020-5-1 14:35   1112  

刘超1,2,秦中平3,魏奉才1,范招纳1,2,赵雯静1,2,王玉敏1,2,卓绍杨1,2,陈健1,2,刘景鹏1,2,刘少华1

(1山东大学齐鲁医院口腔颌面外科,山东大学口腔医学研究所,济南250012;
山东大学口腔医学院口腔外科,济南250012;3临沂市肿瘤医院血管瘤专科,山东临沂276000)

       摘要:目的比较原代细胞注射法和组织块植入法在血管瘤动物模型建立中的可行性。方法收集新鲜增殖期婴幼儿血管瘤标本,取50%组织块植入12只BALB/c裸鼠双侧腋下为组织块组,另外50%组织块培养血管瘤内皮细胞,并将传代细胞植入12只BALB/c裸鼠双侧腋下为细胞组,观察不同生长时期瘤体变化,观察至第7、30、60天分别切取移植瘤组织,HE染色并进行病理学检查。结果第7天,细胞组瘤体小,质软,镜下细胞增殖旺盛,有少量血管生成。组织块组瘤体与机体融合,质软,镜下有大量小血管;第30天,细胞组瘤体体积变大,质稍硬,镜下细胞继续增殖,大量血管生成。组织块组瘤体体积未变化,质硬,有大量的炎细胞,仅残存少量血管;第60天,细胞组瘤体变小,质硬,镜下血管开始萎缩、减少。组织块组瘤体变小,质软,镜下大部分已脂肪化,仅血管周围有少量移植物残留。结论组织块移植法难以建立可靠、稳定的血管瘤模型;原代血管瘤内皮细胞裸鼠皮下注射可以建立可靠的血管瘤模型。

       关键词:血管瘤;裸鼠;动物模型;细胞皮下注射;组织块皮下移植

       血管瘤是常见于婴幼儿的良性肿瘤,治疗手段繁多,但疗效难以令人满意。目前血管瘤的发病机制尚不明确,由于缺乏理想的动物模型,成为制约血管瘤研究的最大瓶颈。迄今为止见诸报道的血管瘤动物模型有鸡冠模型[1]、多瘤病毒模型[2]、转基因动物模型[3]、细胞注射模型[4]和血管瘤组织移植模型[5]等。本研究就血管瘤动物模型中报道较多的血管瘤内皮细胞(hemangiomaendothelialcells,HemECs)皮下注射裸鼠模型和血管瘤组织块皮下移植裸鼠模型进行比较,为选择稳定、可靠的血管瘤动物模型提供实验依据。

       1材料与方法

       1.1材料

       1.1.1标本及动物来源

       收集山东大学齐鲁医院和临沂市肿瘤医院年龄小于3个月且未进行任何治疗的2例手术切除的新鲜婴幼儿血管瘤标本。患儿监护人对本研究知情同意。

       试验用裸鼠(BALB/cnudemice)24只,雌雄不限,鼠龄(28±32)d,体质量(205±21)g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供及饲养。

       1.1.2主要试剂

       内皮细胞基础培养基(Endothe-lialBasalMedium,EBM2)购自Lonza公司,胰蛋白酶、青霉素、链霉素、Gibco胎牛血清(Fetalbovineserum,FBS)购自Invitrogen公司,兔多抗葡糖糖转运蛋白1(RabbitpolyclonalantibodyGlucosetrans-portertype1,GLUT1)、兔抗人第八因子(RabbitantihumanVonWillebrandFantor,vWF)购自ab-cam公司,鼠多抗CD34(MousepolyclonalantibodyCD34)购自SantaCruz公司。

       1.2方法

       1.2.1组织块法培养HemECs

       将手术切除的2例新鲜血管瘤组织置于无血清EBM2培养液中,4℃保存,30min内运至细胞培养室;用PBS将血管瘤标本的凝血块和坏死组织冲洗干净,至肉眼观察冲洗液颜色清亮、无浑浊及脱落组织;用眼科剪和镊去除多余的皮肤及脂肪,选择瘤体组织,适当修剪成1cm3~2cm3的组织块(取50%组织块用于HemECs培养,剩余50%用于构建组织块裸鼠皮下血管瘤模型),加入025%胰蛋白酶,37℃水浴箱中振荡消化10min,加入含10%FBS等体积的EBM2培养液中止消化;将消化后的组织块修剪成1mm3,接种于事先用1%明胶包被的培养瓶内,孵箱内倒置10min。然后加入05mL完全内皮细胞培养基(成分为EBM2培养基、10%FBS、10IU/L青霉素、100mg/L链霉素),仅使培养液刚刚湿润组织块,勿使组织块浮起,放入孵箱内;24h后补充2mL内皮细胞培养基,使培养液缓慢浸润组织块,置孵箱内继续培养;接种后每日观察细胞爬出情况,约1周去除组织块,更换培养液后继续培养;每3d更换培养液1次;细胞汇合成片铺满培养瓶时按1∶3比例传代培养。倒置相差显微镜下观察HemECs的生长情况和形态特征。

       1.2.2HemECs的形态学观察及鉴定

       将原代HemECs接种24孔板中制作细胞爬片,待细胞密度约70%时,取出爬片,PBS冲洗3次,4%多聚甲醛室温下固定10min,PBS冲洗,03%H2O2与甲醇等体积混合液室温下孵育10min,PBS冲洗,10%羊血清封闭10min,分别加入兔抗人vWF(1∶150)和鼠多抗CD34(1∶150),37℃孵育2h,PBS冲洗,加入二抗+HRP37℃孵育1h。PBS冲洗,DAB显色,苏木素复染,封片。

       1.2.3动物模型的建立及观察

       将24只试验用裸鼠分为组织块组和细胞组,每组各12只。组织块组,将修剪并冲洗过的1cm3瘤体组织直接种植于12只裸鼠双侧腋窝处皮下;细胞组,胰酶消化收集培养的第三代HemECs,以107cells/mL密度重悬于完全培养基中,以200μL/部位注射至12只裸鼠双侧腋窝皮下。记录第7、30、60天细胞组和组织块组血管瘤模型的变化,包括瘤体大小、颜色和质地,并各组各时间点随机选取4只裸鼠切取瘤体,HE染色,镜下观察组织学变化。

       2结 果

       2.1HemECs的培养及鉴定

       组织块法培养HemECs,细胞贴壁后表现为多角形或梭形,集簇生长;内皮细胞标记物vWF和CD34,均呈阳性表达。

       2.2细胞注射法血管瘤裸鼠模型的建立

       12只裸鼠经HemECs注射后,双侧全部成瘤。第7天可见小米粒样凸起,约1mm×1mm×1mm,质软,部分HemECs开始形成血管;第30天生长至5mm×4mm×3mm,颜色无变化,质稍硬,有大量HemECs围成的小血管,部分区域可见大血管形成;第60天肿瘤为2mm×3mm×2mm,质硬,部分HemECs开始凋亡,血管萎缩。

       2.3组织块移植法

       血管瘤裸鼠模型的建立组织块移植后,1只裸鼠因感染死亡,2只裸鼠因缝线过早脱落导致组织块从体内移出,其余9只均双侧呈瘤。第7天组织块已与机体融合,质软,镜下见众多小血管;第30天瘤体约2mm×2mm×2mm,质硬,镜下见大量细胞变性、坏死,仅见少量血管残留;第60天移植组织已完全消退,镜下见移植物大部分已脂肪化,仅少量血管周围有残留移植物。

       3讨 论

       鸡冠模型等低等动物的血窦样器官不能真正地反映在人体内血管瘤生长发育的情况;多瘤病毒模型肿瘤生长迅速,常伴发脑出血和贫血,导为更好研究血管瘤的发病机制和药物作用机制,探索新的治疗方法,从而提高血管瘤的临床诊疗效果,亟待建立一个理想的血管瘤动物模型。然而,目前报道的大多数血管瘤动物模型都不能模拟血管瘤生长、消退的自然过程,而且不能表现出类似的组致模型动物很快死亡;转基因小鼠模型所形成的肿瘤组织学特征偏恶性,更接近于血管肉瘤或血管内皮瘤等[1,3,6]。这些模型在一定程度上反映血管瘤生长的过程和规律,但都不是血管瘤的理想模型。

       虎小毅等[4]利用细胞悬液注射法建立血管瘤模型,所得到的移植瘤生物学特性与正常人体增殖期血管瘤生物学特性相似。Tang等[5]利用新鲜血管瘤组织块移植法建立血管瘤模型,瘤体能在体内生长并模拟血管瘤的生命进程。细胞悬液注射法和组织块移植法因其操作简单,且能较为真实地反映血管瘤的发展过程,是建立血管瘤模型较为理想的方法。但这两种方法的优缺点文献报道各不一致,本研究对此进行了实验比较,发现采用单纯的血管瘤组织块进行裸鼠移植,对组织块条件要求较高,而且要求获得标本后立即操作,无法同时建立大量模型。移植后组织块在裸鼠体内呈明显的消退现象,很快在裸鼠体内被包裹、吸收,导致移植失败。其原因可能是血管瘤是良性肿瘤,在动物体内侵袭性小,增殖缓慢;血管瘤移植物在裸鼠体内存活需要特定的条件,如某些激素或体液因子的参与,移植物内部缺乏营养供应和各种因子刺激,很快会发生坏死,这可能是其移植法失败的主要原因。目前对于血管瘤自发性消退期脂肪化的机制尚不明确,诸如外周循环内皮细胞、免疫细胞和各种生长因子等,都可能是诱因。

       据文献报道[2,7],鼠血管内皮瘤细胞已被在体外培养成功,多瘤病毒转染细胞注射后也会形成皮肤血管瘤,但是所建立的模型中血管瘤不能自行消退,实验动物也会在3~10个月内死亡。本研究使用的原代HemECs来自于快速增殖期婴幼儿血管瘤,瘤细胞活力强,将细胞注射入裸鼠皮下后,在24个(12只裸鼠双侧腋下)肿瘤注射处得到了100%的成功率。第7~30天增殖期迅速生长,第30天时瘤体最大,之后萎缩进入消退期,形成的模型与临床上婴幼儿血管瘤的发生发展和消退过程基本一致,表明了模型的稳定性。注射的细胞用HemECs特异性标志物CD34、vWF[8-9]检测,均呈阳性表达,说明该细胞是血管瘤来源的内皮细胞。本研究中HemECs的培养条件成熟[10],呈多角形或梭形集簇生长,与其他学者的研究相似[11]。另外,如系恶性肿瘤的移植,一般要求传代接种,以证明其成功,但移植良性肿瘤,因其相对恶性肿瘤更为困难,无须用传代接种来证明其成功,只需证明移植瘤在动物体内可持续繁殖和存活,移植瘤的形态、功能与原人体肿瘤保持一致即可。

       血管瘤被称为肿瘤而区别于脉管畸形,其主要原因为血管瘤的发生发展及消退主要表现为HemECs和外周细胞的变化,而HemECs被认为是体现该进程的标志细胞[12]。对于HemECs来源的问题,由于HemECs与胎盘毛细血管共同表达GLUT1、CD174和CD32等因子,部分学者[13-14]认为其来自于胚胎母细胞;而近年更多学者[15]更加关注血管瘤干细胞(hemangiomaendothelialprogenitorcells,HemEPCs)的研究,并建立了血管瘤特异性标记物GLUT1表达阳性的动物模型,这些为更全面的研究血管瘤的发病机制提供了帮助。无论HemECs起源于何处,最终都造成血管瘤发生发展及消退。如何获取特异性更强的HemECs,是建立稳定血管瘤模型的关键,也是我们今后研究的重点。
建立一个稳定性好、特异性强的动物模型,是进行治疗等进一步研究的基础。组织块移植法因高失败率和无法大量建模的缺点,很难为实验所用。而HemECs裸鼠皮下注射法成功率100%,持续时间长达60d,既便于提高实验效率,也可为进行药物筛选及药效观察提供充足时间,因此HemECs裸鼠皮下注射法是建立血管瘤动物模型较为理想的方法选择。


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