近年来，国外在血管瘤动物模型方面进行了大量研究，并取得了初步成果。Hoak等(1971)给同源小鼠移植血管内皮瘤(恶性)，制作出血管瘤 (Kasabach-Merritt综合征)模型。但这种肿瘤为混合细胞型，其中的非内皮细胞可能有助于肿瘤形成。Toda等(1990)给裸鼠接种取自以紫外线诱发的鼠皮肤肿瘤培养的细胞系，从而制作出血管瘤性囊肿模型。其方法是以太阳灯作为紫外线放射源， 这些灯源可提供连续紫外光波，波峰305 nm。光源距裸鼠(nu/nu) 15cm，输出功率为0. 44 mW/ cm²。照射方法为每周3次，每次1h，持续27周。将诱发肿瘤取下作原代培养，形成2个细胞系。F-2为具有致瘤性的鼠血管内皮细胞系，另一细胞系为纤维肉瘤细胞系。培养后1〜7d计算细胞数量，当细胞数量倍增至1X105〜1X106时，将其接种于CRF，裸鼠背部。注射后1周，在注射部位出现软组织出血性肿瘤。肿瘤与其深层组织粘连，由充满血液、含包膜的囊肿构成。囊壁内衬几层肿瘤细胞，偶尔围成腔隙，形成毛细血管样结构。笔者认为，F-2细胞系为具有致瘤性及血管内皮细胞特征的转化细胞系，以其诱导的肿瘤模型，可用于研究血管性肿瘤的生物学行为。但与真正的血管瘤相比，该动物模型尚有很大差距。 Bautch等(1987)的研究表明，表达多瘤病毒 (polyoma virus, Py)早区基因的转基因小鼠，可产生多灶性、致死性血管瘤，这些肿瘤通常发生于成年小鼠的多个部位。从这些小鼠血管瘤中，Dubois等(1991)成功分离并培养出一个细胞系，称为Py-4-l，已连续传代100次以上。Py-4- 1细胞具有血管内皮细胞的某些特性，如融合时呈大卵石样，接触抑制生长，表达vWF ( von Willebrand因子)，活跃吸收低密度乙酰脂蛋白。在基膜样基质上培养时，可形成毛细血管样结构。在裸鼠和组织相容性小鼠，Py-4-l细胞尚表现出致瘤性。Dubois- Stringfellow 等(1994)在组织相容性小鼠大腿皮下或腹膜腔内注射纯Py- 4-1培养细胞(3X10M00闰PBS)，结果注射部位100%出现单发血管瘤，且具有Kasabach - Merritt综合征的许多特征，包括血小板减少、贫血、脾肿大。红细胞计数、Hb浓度、红细胞压积及血小板计数变化与血管瘤大小直接相关。笔者认为，该模型可用于研究血管瘤的生物学机制以及探索治疗方法，是比较接近的Kasabach - Merritt综合征模型。 研究发现，怀孕母鼠感染多瘤病毒后，新生小鼠患血管瘤的机会大大增加。以分子生物学方法分析患病小鼠的基因结构，证实小鼠多瘤病毒 Middle T抗原基因整合到正常小鼠基因序列之中，是小鼠产生多发性血管瘤的原因。多瘤病毒属乳多空病毒属，Py基因是环状双链DNA分子，5. 3 kb大小。在其早期编码区内包括Small T、Middle T、Large T这3种抗原基因。Py基因组早期复制区内的hr-t基因可以使T抗原Tyr - 315 位磷酸化，促使Py-MT基因产物具有转化活性。 体外实验证实，血管内皮细胞是Py-MT的主要靶细胞。Py-MT可以快速转化血管内皮细胞，直接诱导肿瘤形成而无需其他诱变过程辅助参与。Py-MT蛋白定位于细胞质膜，受到某些特定信号传导分子活性的调节，特别是酪氨酸激酶的Src家族。Py-MT形成血管瘤的分子机制目前尚不十分清楚，除与信号传导途径有关外，也可能与基质降解蛋白水解酶和细胞因子有关。Py-MT转化的细胞可表达bFGF与FGFR - 1以及VEGFR - 20在IL-l、TNF-a或内毒素的刺激下，Py-MT 转化的细胞可表达一系列其他的细胞因子，包括IL-6、粒细胞克隆刺激因子、粒-巨细胞克隆刺 因子、单核细胞趋化因子等。 上海交通大学医学院附属第九人民医院血管瘤课题组与上海南方模式生物研究中心合作，釆用 DNA显微注射、转基因技术，在国内首次构建了Py-MT转基因血管瘤小鼠动物模型。实验采用的注射基因为包含Py基因早期序列和MT抗原基因的DNA。实验成功获得具有血管瘤表型的小鼠，在小鼠唇、舌、掌心、皮肤及内脏黏膜表面均可见广泛表达的血管瘤样新生物。经组织学检查，证实新生物为血管瘤（图3-10）。阳性小鼠DNA经PCR鉴定，证实整合有Py-MT基因；而在野生型小鼠和阴性小鼠中未检测到该基因表达。实验表明：采用转基因技术将Py-MT整合到正常小鼠基因组序列中，可以确切地产生血管瘤；检测整合有Py-MT基因的小鼠，均发现血管瘤表型，推测Py-MT基因为显性表达基因。但是上述实验也存在明显缺陷，即产生血管瘤的小鼠，其全身皮肤、黏膜乃至重要脏器都表达血管瘤，导致阳性小鼠生存时间过短，无法获得稳定传代的小鼠系，不能作为理想的血管瘤动物模型应用，也无法进一步了解Py-MT原的作用受体或靶点，研究其致瘤机制。   图3-10肿瘤由大量内皮细胞和新生血管组成(光镜下) 有鉴于此，课题组正在重新构建Py-MT显微注射基因，使其携带有小鼠乳腺特异表达的乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子或涎腺特异表达的淀粉酶基因(AMLlc)启动子，以期转基因小鼠血管瘤特异性地表达在小鼠乳腺或下颌下腺，避免累及全身重要脏器，从而延长小鼠寿 命，进而获得稳定传代的小鼠系。同时将瘤组织上皮细胞分离培养，反复筛选，建立一株生物学稳定的血管内皮细胞株。目前，这一研究正在进行中。 |
