摘要:目的观察普萘洛尔对体外培养的血管瘤内皮细胞凋亡的影响。方法取婴幼儿增殖期血管瘤标本，用组织块法原代培养血管瘤内皮细胞，并用第Ⅷ凝血因子相关抗原进行鉴定。待细胞处于对数生长期，换无血清培养基孵育48h，使细胞同步化，然后分别加入0．5μmol·L－1和1．0μmol·L－1的普萘洛尔作为干预组，而对照组不加任何干预因素，继续孵育24h，检测血管瘤血管内皮细胞凋亡率。结果血管瘤内皮细胞于组织块接种后3～4d开始贴壁生长，内皮细胞呈多角形态，3～4周细胞开始快速生长，并铺满板底。培养细胞第Ⅷ凝血因子相关抗原表达为阳性。普萘洛尔作用24h后，0.5μmol·L－1普萘洛尔组和1．0μmol·L－1普萘洛尔组血管瘤内皮细胞凋亡率分别为(22．42±0．83)%、(24．36±1．42)%，较对照组［(15．72±0．59)%］均明显升高(Pa＜0.01)。结论普萘洛尔可以促进体外培养的血管瘤内皮细胞凋亡或抑制其增殖。 Léauté－Labrèze等［1］在用普萘洛尔治疗婴幼儿心脏病时，意外发现患儿处于增殖期的血管瘤迅速变小、褪色。继而有数名临床医师尝试将普萘洛尔用于婴幼儿血管瘤的治疗，并取得了较理想的疗效，但其作用机制迄今仍不清楚［2-3］。本研究通过观察普萘洛尔对体外培养血管瘤内皮细胞凋亡的影响，为临床应用普萘洛尔治疗婴幼儿血管瘤提供实验参考。 1材料与方法 1．1标本来源及试剂血管瘤标本来源于本院住院的1例3个月女婴(2010年9月10日采集于遵义医学院附属医院)，右胸壁血管瘤，瘤体巨大且增长迅速，家属强烈要求手术切除。M199培养基、明胶(美国Gibco公司)，二甲基亚砜(美国Sigma公司)，小牛血清(美国Hyclone公司)，培养皿、培养板(美国Falcon公司)，兔抗人第Ⅷ凝血因子相关抗原抗体(武汉博士德公司)，AnnexinⅤ/FITC凋亡检测试剂盒(美国Qbiogene公司)，FASCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。 1．2血管瘤内皮细胞的分离培养、鉴定及分组取新鲜血管瘤标本，轻轻剥离单个瘤体至培养皿中，PBS冲洗分离出的单个瘤体(含瘤体的组织块)，剥离瘤体包膜，PBS再次冲洗瘤体，将单个瘤体剪碎至约1mm3大小，并置于培养瓶中，组织块间距3mm，倒置培养瓶中，放入37℃恒温箱中温育6h，弃上清液，加入含100mL·L－1小牛血清和70μg·L－1成纤维生长因子的M199培养液(pH值7.2)，然后分装在铺有明胶的25mL塑料培养瓶中，置于37℃50mL·L－1二氧化碳(CO)饱和湿度的培养箱中孵育，第2天换液，以后每2～3d换液1次，30d后长成单层细胞，待细胞铺满瓶底后即可用2.5g·L－1胰蛋白酶再次传代。培养过程中通过加入肝素、差速消化法传代等传至第3代获取较纯细胞后，用第Ⅷ凝血因子相关抗原鉴定。取对数生长期细胞，换无血清培养基孵育48h，使细胞同步化，然后分为3组:0.5μmol·L－1普萘洛尔组、1．0μmol·L－1普萘洛尔组和对照组(不加任何干预因素)。 1．3流式细胞仪检测血管瘤内皮细胞的凋亡消化后收集内皮细胞分3个样本，每个样本取总数约为1×105的细胞，顺序加入5μLAnnexinⅤ/FITC及10μL碘化丙啶溶液(PI)双染色上机，流式细胞仪检测血管内皮细胞的凋亡率，CellQuest软件分析结果。 1.4统计学处理采用SPSS17．0软件进行处理，计量数据以x珋±s表示，多组间比较行单因素方差分析(One－WayANOVA)。P＜0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1体外培养的血管瘤血管内皮细胞的观察增殖期血管瘤内皮细胞体外培养易成活。组织块接种后3～4d，血管瘤内皮细胞开始出现贴壁生长，用相差倒置显微镜观察，发现所分离的细胞呈上皮细胞形态，为多角形或梭形。细胞培养3～4周呈旋涡式生长，见图1。
2．2 血管瘤内皮细胞的鉴定 第Ⅷ凝血因子抗原主要表达于血管瘤内皮细胞的细胞质，倒置相差显微镜下观察可见血管瘤内皮细胞的细胞质散在棕黄色阳性颗粒，见图2，结合培养细胞形态学特征，证实分离培养的内皮细胞为人的血管内皮细胞。 2．3普萘洛尔对血管瘤内皮细胞凋亡率的影响普萘洛尔作用24h后，0.5μmol·L－1普萘洛尔组与1．0μmol·L－1普萘洛尔组血管瘤血管内皮细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，但2组均显著高于对照组(Pa＜0.01)，见图3、表1。
3讨论 血管瘤内皮细胞的体外培养有2种主要的方法:消化法和组织块法。消化法培养的血管瘤内皮细胞，主要来自几个微小的组织块，生长快，而散在的内皮细胞由于受周围纤维细胞的影响难以生长。与传统的消化法相比，组织块结合酶消化法的优点在于细胞损伤较小，便于细胞贴壁生长，避免了因组织消化而混入大量的纤维细胞，可以提高内皮细胞的纯度，并抑制成纤维细胞生长。本实验采用组织块结合酶消化法［4］，发现大量血管瘤内皮细胞从组织块边缘长出，细胞形态单一、整齐，易成活。 血管瘤是小儿最常见的肿瘤之一，其主要病理表现是血管过度形成，并随患儿年龄增长自发性血管退化，对于体积大、生长迅速、有压迫症状，甚至影响器官功能的血管瘤应及早治疗。目前血管瘤的治疗方法很多，但是没有一种治疗方法对所有血管瘤有效，且治疗本身也可能引起一些严重并发症。Léauté－Labrèze等［1］在首次报道用普萘洛尔治疗2例心脏疾病并血管瘤患儿时，意外发现患儿的血管瘤萎缩变小，颜色变浅。在征得家长同意后，另9例颌面部血管瘤患儿口服普萘洛尔进行治疗，患儿在用药后均出现了瘤体颜色变浅，体积不同程度缩小。证实普萘洛尔对婴幼儿血管瘤治疗的确切效果。随后有学者分别报道予醋丁洛尔或普萘洛尔口服治疗后，血管瘤好转［5-11］。提示普萘洛尔治疗血管瘤有效，且具有不良反应少的优点，有成为婴幼儿血管瘤治疗的一线药物的潜质。本研究中，0.5μmol·L－1、1.0μmol·L－1普萘洛尔组血管瘤血管内皮细胞凋亡率均较对照组明显升高(Pa＜0．01)，表明普萘洛尔可以抑制血管瘤内皮细胞的增殖或促进其凋亡，从实验角度证实了普萘洛尔对血管瘤的治疗作用。 |
